一、为什么划不出单个菌落？

1、平板上有过多的水分；

2、在划线时没有反复灼烧接种环；

3、多区划线，三区或四区划线，越是稀释到4区，间距要越宽。

二、培养基配制时应注意的问题

1、严格控制灭菌温度，需要按照要求进行灭菌操作。如果培养基的含糖量较高，那么灭菌温度就不能太高，否则就会使糖分焦化，从而影响培养基的质量。

2、不能反复融化琼脂培养基，这会对培养基中的营养成分产生破坏。

3、不能对培养基进行反复灭菌，这同样也会对营养成分产生破坏作用。 

4、在对琼脂培养基进行灭菌后需要将其充分摇匀。

5、需要将培养基完全溶解才能分装培养基。

三、培养基的保存

1、平板：大多数平板如VRBA、DC、尿素酶生化管、显色系列等要避光低温保存。

2、干粉培养基：避光干燥，结块后不能使用。

3、亚碲酸钾卵黄增菌液、50%卵黄乳液等：冷冻保存，使用时，要常温解冻，不能使用水浴加热。

4、抗生素类：冷藏保存，温度过高会导致灵敏度的下降。

5、兔血浆：冷藏保存少量的红色不会影响结果。

四、观察时间的掌握

按SN、GB等标准或培养基的使用说明所述时间进行观察，时间过短或时间过长，单菌落的特征都不会很明显。如单增李斯特氏菌显色培养基，时间短单菌落看不到卵磷脂环，时间长绵羊李氏菌也会产生沉淀环。OXA、PALCAM的观察也如此，时间过长，李氏菌使整个平板成黑色，不利于观察单个菌落。霉菌要3天后要及时观察计数，防止时间长成一片。

五、添加剂的添加

1、温度的掌握:卵黄和抗生素类添加的温度都不应太高。

2、定量: 过多会抑制一些目标菌，太少又导致杂菌的过度生长。

六、培养温度的掌握

1、真菌类：25-28℃培养

2、细菌类：李氏菌在增菌和生化中要求培养温度在30℃左右。

3、其他一般在36℃左右

七、常用的接种方法

穿刺接种、倾注接种、涂布接种、划线接种。