一、适用范围

本方法适用于生活饮用水及其水源水、地表水、污水、废水等水中粪大肠菌群（耐热大肠菌群）的定性检测、定量检测。

二、方法原理

固定底物酶底物法（DST）采用大肠菌群细菌能产生β-半乳糖苷酶分解ONPG使培养液呈黄色的原理，来判断水样中是否含粪大肠菌群（耐热大肠菌群），粪大肠的培养温度是44.5℃。

三、仪器设备

1、程控定量封口机

2、电热恒温培养箱

3、冰箱

4、51孔定量盘、97孔定量盘

5、100ml无菌水样瓶

6、高压蒸汽灭菌锅

7、干热灭菌器

8、量筒

9、吸管

10、试管

四、培养基和试剂

1、科立得（固定底物技术酶底物法）检测试剂：MMO-MUG培养基。

2、无菌水

五、样品的采集和保存

1、采样前准备

采样瓶：采用IDEXX公司科立得 系统配套的灭菌100毫升消毒带刻度容器。

2、样品采样及注意事项

（1）将已灭菌和封包好的采样瓶，无论在什么条件下采样时，均要小心开启包封纸和瓶盖，避免瓶盖及瓶子颈部受杂菌污染，并注意在使用船只或附带的采样绳等附加设备采样时可能造成的污染。

（2）在采集江、河、湖、库、地表水样时，可握住瓶子底部直接将采样瓶插入水中，约距水面10~15厘米处，瓶口朝来水方向，使水样灌入瓶内。如果没有水流，可握住瓶子水平前推，直至充满水样为止。采好样后，迅速盖上瓶盖和包装纸。采样后，采样瓶内上部应留有一些空隙，以便检验前充分混匀水样。

（3）用采样器采样时，将无菌的水样瓶放入架内。将采样装置放入水中。到达预定深度后，打开瓶塞，待水样灌好后，松开瓶塞的软绳，盖上瓶盖。再将整个装置提出水面。

（4）从自来水龙头采集样品时，不要选用漏水的龙头，采水前可先将水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌或用70%的酒精溶液消毒水龙头及采样瓶口，然后将水龙头完全打开，放水数分钟后除去水管中的滞留杂质。采水时控制水流速度小心接入瓶内。

（5）在同一采样点进行分层采样时，应自上向下进行，以免不同层次的搅扰；同一采样点与理化监测项目同时采样时，应先采集细菌等检验样品，否则样品可能被污染，采样前，不得用水样刷洗采样瓶。

（6）采样完毕，应将采样瓶编号、作好采样记录。将记录下采样条件，填入采样表格内。

（7）样品的运输和保存：采好的水样，应迅速运往实验室，进行细菌学检验，一般从取样到检验不宜超过2小时，不然应使用10℃以下的冷藏设备保存样品，但不得超过6小时，实验室接到送检样后，应将样品立即放入冰箱，并在2小时内着手检验。如果因路途遥远，送检时间超过6小时者，则应考虑现场检验。

3、样品交接

样品运回实验室后，由采样人员与质管科样品管理人员进行交接。双方需对样品名称、编号、样品采集点名称、采样时间、数量、采样人签名等进行登记核实。如在验收过程中，发现编号错乱、字迹不清、规格不符、监测项目不明及采样不合要求者，可拒收并建议补采。如无法补采，应经领导批准，方可收样测定。样品管理人员收样后应尽快转交检测人员以便及时进行分析。

4、干扰与消除：

防止操作过程中的污染，严格无菌操作。

六、操作步骤

1、水样稀释

检测所需水样为100mL。若水样污染严重，可对水样进行稀释。取10 mL水样加入到90 mL无菌水中，必要时可加大稀释度，水样按照10倍逐级稀释。

2、定性反应

用100 mL的无菌稀释瓶量取100 mL水样，加入科立得培养基粉末，混摇均匀使之完全溶解后，放入44.5℃的培养箱内培养24h。

3、51孔定量盘法

（1）用100mL的无菌稀释瓶量取100mL水样，加入科立得培养基粉末，混摇均匀使之完全溶解。

（2）将前述100mL水样全部倒入51孔无菌定量盘内，以手抚平定量盘背面以赶除孔穴内气泡，然后用程控定量封口机封口。放入44.5℃的培养箱内培养24h。

（3）无需稀释检测范围：1-200MPN/100mL粪大肠菌群（耐热大肠菌群）

4、97孔定量盘法

（1）将100mL水样全部倒入97孔无菌定量盘内，其余步骤与6.3.1、6.3.2条款相同。

（2）无需稀释检测范围：1-2419MPN/100mL粪大肠菌群（耐热大肠菌群）

七、结果报告

1、结果观察与报告

（1）结果判读

将水样培养24h后进行结果判读，如果结果为可疑阳性，可延长培养时间到28h进行结果判读，超过28h之后出现的颜色反应不作为阳性结果。

（2）定性反应

水样经24h培养之后如果颜色变成黄色，判断为阳性反应，表示水中含有粪大肠菌群（耐热大肠菌群）。水样颜色未发生变化，判断为阴性反应。定性反应结果以粪大肠菌群检出或未检出报告。

（3）51孔定量盘法、97孔定量盘法

①将培养24h的水样的定量盘取出观察，如果颜色变成黄色则表示定量盘孔中含有粪大肠菌群（耐热大肠菌群）。若无法明显辨别黄色孔格，则可借助97孔阳性比色盘比色判读。检测结果说明如下：

②计算有阳性反应的孔穴数，对照附表1：51孔定量盘MPN表或者附表2：97孔定量盘MPN表查出代表的粪大肠菌群（耐热大肠菌群）最可能数。结果以MPN/100mL表示。如所有孔未产生黄色，则可报告为粪大肠菌群（耐热大肠菌群）未检出。

③在无需稀释检测范围内直接可读出结果。若水中粪大肠菌群（耐热大肠菌群）污染严重，超出定量范围（全部孔格显黄色）则需要稀释，读取结果后再乘以稀释倍数。

八、质控

每批科立得试剂需做验证检验：向一份100mL无菌水样中接种含有粪大肠菌的质控样标准菌株，按照上述定量检测步骤操作观察结果，看结果是否在其范围内。

九、注意事项

1、如果水样品有背景颜色，需做一个空白试验，与科立得标准检测结果相比较。

2、只可使用灭菌水，不含缓冲液的水，不含氧化剂的水进行样品稀释。

3、此法所用试剂只用于常规水样，不可用于浓缩水样。

4、如水样中含有过多的氯，则加入科立得试剂可能显蓝光，则该水样不可用此方法。

5、此法无需在无菌室中进行，但操作过程因避免微生物污染。

6、检测使用过的定量盘应灭菌后弃去。把约30个定量盘放入防爆袋中，用绳子松松的扎住袋口，放入高压蒸汽灭菌锅中，121℃高压灭菌20min后取出，在防爆袋上注明“生物垃圾已灭菌”方可弃去。

附表1：51孔定量盘MPN表

附表2：97孔定量盘MPN表